TRATTAMENTO BiMoC B&B PRE-ESTRAZIONE DELLE FECI E SALIVA
Background
I
metodi molecolari per la rilevazione e la caratterizzazione dei microrganismi hanno rivoluzionato la microbiologia diagnostica e fanno ora parte del trattamento di routine dei campioni, perché sono molto veloci, specifici e sensibili rispetto ai metodi diagnostici di routine [1]. Recentemente, sono stati sviluppati test multiplex della reazione a catena della polimerasi (PCR) nelle feci per identificare i patogeni intestinali, ma la presenza di inibitori deve essere rimossa mediante uno speciale pretrattamento del campione [2].
La qualità e la quantità degli inibitori della PCR nelle feci variano tra i campioni, pertanto i metodi di estrazione del DNA sono fondamentali per estrarre una quantità e una qualità sufficienti di materiale genetico dai campioni di feci, soprattutto quando è necessario rilevare vari tipi di specie di organismi [3].
La
saliva viene utilizzata come campione alternativo poiché la sua raccolta non è invasiva, economica, facile e può essere eseguita rapidamente e in massa [6]. La saliva potrebbe essere utilizzata per identificare l'agente infettivo di alcune infezioni delle vie respiratorie inferiori (LRI) e delle vie respiratorie superiori (URI) o dell'infezione orale da papillomavirus umano (HPV).
Tuttavia, il potenziale di inibizione della saliva è stato descritto in letteratura ed è stato un ostacolo rilevante per un uso più diffuso di questo campione nei test diagnostici, quindi gli inibitori devono essere rimossi prima o durante l’estrazione degli acidi nucleici [7].
A livello globale, si stima che ogni anno si verifichino 6-60 miliardi di casi di infezioni gastrointestinali [4,5].
Nel 2019 a livello globale si sono verificati 489 milioni di episodi di LRI, che hanno portato a un totale di 2,5 milioni di decessi e i casi incidenti di infezioni delle vie respiratorie superiori da URI hanno raggiunto 17,2 (intervallo di incertezza al 95%: da 15,4 a 19,3) miliardi [ 8,9]. Tra i paesi ad alto reddito, si stima che 21.000 tumori orofaringei all’anno siano attribuibili all’HPV [10]. Per tutte queste malattie è fondamentale una rapida identificazione dell'agente infettivo e quindi del trattamento specifico, che può essere effettuata con metodi molecolari.
Scopo
Considerando che il trattamento pre-estrattivo di feci e saliva è fondamentale per il rilevamento di DNA e RNA di agenti infettivi (batteri, funghi, parassiti, virus) e che
la maggior parte dei trattamenti pre-estrattivi disponibili in commercio sono costosi e richiedono molto tempo, BiMoC ha sviluppato un protocollo di pre-estrazione economico e veloce per feci e saliva.
Campioni
Circa 4 g o 200 uL, se liquide, di feci raccolte in un contenitore sterile*, 1 ml di saliva raccolto direttamente in una provetta di raccolta sterile* da 4 ml. * non essenziale.
Protocollo
Aggiungere il buffer iniziale BiMoC al campione e applicare il protocollo BiMoC (15 minuti) e utilizzare il surnatante per l'estrazione secondo le istruzioni del produttore del kit in uso.
Validazione
500 campioni di feci e saliva raccolti da pazienti con o senza manifestazioni cliniche, sono stati pretrattati e il surnatante è stato utilizzato per l'estrazione di DNA e RNA utilizzando:
- Mini Kit DNA, Qiagen (manuale),
- Mini Kit RNeasy, Qiagen (manuale),
- Kit QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi, Qiagen (automatizzato),
- Estrazione del DNA/RNA del patogeno EU-Mag, PurePrep, Molgen, Eurospital (automatizzata).
I campioni di feci sono stati analizzati con:
- Allplex Gastro, Seegene, PCR Real time multiplex per il rilevamento di 25 target: 13 batteri, 6 virus e 6 parassiti in 4 pannelli e tramite,
- Allplex Candidiasis Assay, PCR Real time multiplex per la rilevazione di 7 specie di Candida.
I campioni di saliva sono stati analizzati con:
- Allplex Respiratory Full Panel, Seegene, multiplex Real time PCR per la rilevazione di 19 virus e 7 batteri e mediante,
- NeoPlex COVID-19 Fast Kit, Genematrix, per il rilevamento della SARS CoV2 e di,
- Anyplex II HPV28 Detection Assay, Seegene, multiplex Real time PCR per il rilevamento di 28 genotipi HPV.
Risultati
Tutti i patogeni ed i controlli interni sono stati rilevati.
Conclusioni
Il pretrattamento BiMoC è un metodo economico e veloce adatto alla purificazione delle feci e della saliva prima dell'estrazione del genoma batterico, virale, parassitario e fungino.
Per saperne di più contatta BiMoC: info@bimoc.it
PRE-EXTRACTION TREATMENT OF STOOL AND SALIVA
Background
Molecular biological methods for the detection and characterization of microorganisms have revolutionized diagnostic microbiology and are now part of routine specimen processing, because they are very fast, specific and sensitive respect to the routine diagnostic methods [1].Recently,
stool multiplex polymerase chain reaction (PCR) tests have been developed for identifying intestinal pathogens, but the presence of inhibitors must be removed by a special sample pretreatment [2].
The quality and quantity of PCR inhibitors in stool vary between samples, therefore, DNA extraction methods are crucial to extract a sufficient quantity and quality of genetic materials from stool samples, especially when various types of organism species need to be detected [3].
Saliva is used as an alternative sample as its collection is non-invasive, cheap, easy and can be done quickly and in bulk [6]. Saliva could be used to identify the infectious agent of some Lower Respiratory Tract Infections (LRI) and Upper Respiratory Tract Infections (URI) or Human Papillomavirus (HPV) oral infection.
However, the inhibition potential of saliva has been described in the literature and has been a relevant obstacle to more widespread use of this specimen in diagnostic tests, so inhibitors must be removed before or during nucleic acids extraction [7].
Globally, it is estimated that 6-60 billion cases of gastrointestinal infection occur annually [4,5]. In 2019 globally, 489 million LRI episodes occurred, leading to a total of 2·5 million deaths and the incident cases of Upper Respiratory Tract Infections URI reached 17·2 (95% uncertainty interval: 15·4 to 19·3) billion [8,9]. Among high-income countries, 21,000 oropharyngeal cancers per year are estimated to be attributable to HPV [10].
For all these diseases a rapid identification of the infectious agent and therefore of the specific treatment, that can be done by molecular methods is fundamental.
Aim
Considering that the pre-extraction treatment of feces and saliva is critical for the detection of DNA and RNA of infectious agents (bacteria, fungi, parasites, viruses), and that the most pre-extraction treatments commercially available are expensive and time consuming, BiMoC has developed a cheap and fast pre-extraction protocol for stool and saliva.
Samples
- about 4 g or 200 uL, if liquid, of stool collected in a sterile* container,
- 1 ml of saliva directly collected in a 4 ml sterile* collection tube.
* not essential.
Protocol
Add the
BiMoC starting buffer to the sample and apply
BiMoC protocol (15 minutes) and use the supernatant for the extraction according to the manufacturer instructions of the Kit in use.
Validation
500 samples of stool and saliva collected from patients of with or without clinical manifestations, were pretreated and the supernatant was used for the extraction of DNA and RNA by using:
- DNA Mini Kit, Qiagen (manual),
- RNeasy Mini Kit, Qiagen (manual),
- QIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit, Qiagen (automated),
- EU-Mag Pathogen DNA/RNA Extraction, PurePrep, Molgen, Eurospital (automated).
Stool samples were analyzed by:
Stool samples were analyzed by:
- Allplex Gastrointestinal assay, Seegene, multiplex Real time PCR for the detection of 25 targets: 13 bacteria, 6 viruses, and 6 parasites in 4 panels and by,
- Allplex Candidiasis Assay, multiplex Real time PCR for the detection of 7 species of Candida.
Saliva samples were analyzed by:
- Allplex Respiratory Full Panel, Seegene, multiplex Real time PCR for the detection of 19 viruses and 7 bacteria and by,
- NeoPlex COVID-19 Fast Kit, Genematrix, for the detection of SARS CoV2 and by,
- Anyplex II HPV28 Detection Assay, Seegene, multiplex Real time PCR for the detection of 28 HPV genotypes.
Results
All targets and all internal controls were amplified.
Conclusions
BiMoC pretreatment is a cheap and fast method suitable for stool and saliva purification before bacterial, viral, parasitic and fungal genome extraction.
For more information contact BiMoC: info@bimoc.it
BIBLIOGRAFIA- BIBLIOGRAPHY
1 David J Speers, Clinical Applications of Molecular Biology for Infectious Diseases. Clin Biochem Rev. 2006 Feb; 27(1): 39–51.
2 Jae Sung Ahn et al., Efficacy of stool multiplex polymerase chain reaction assay in adult patients with acute infectious diarrhea. World J Clin Cases. 2020 Sep 6; 8(17): 3708–3717. Published online 2020 Sep 6. doi: 10.12998/wjcc.v8.i17.3708
PMCID: PMC7479561 PMID: 32953847.
3 Siriporn Srirungruang et al., Comparative Study of DNA Extraction Methods for the PCR Detection of Intestinal Parasites in Human Stool Samples. Diagnostics 2022, 12(11), 2588; https://doi.org/10.3390/diagnostics12112588.
4 The Global Burden of Infectious Diseases Through the Gastrointestinal Tract: A Critical Scientific Assessment of Exposure,sponsored by the American Academy of Microbiology and held February 15-18, 2002, in Galway, Ireland. Washington (DC): American Society for Microbiology; 2002.
5 Muhammad Amjad, An Overview of the Molecular Methods in the Diagnosis of Gastrointestinal Infectious Diseases. Int J Microbiol. 2020; 2020: 8135724. Published online 2020 Mar 24. doi: 10.1155/2020/8135724.
6 James Riddell et al., Oral human papillomavirus prevalence, persistence, and risk-factors in HIV-positive and HIV-negative adults. Tumour Virus Res. 2022 Jun; 13: 200237. Published online 2022 Apr 20. doi: 10.1016/j.tvr.2022.200237 PMCID: PMC9062318 PMID: 35460939.
7 A S Ochert et al., Inhibitory effect of salivary fluids on PCR: potency and removal PCR Methods Appl 1994 Jun;3(6):365-8. doi: 10.1101/gr.3.6.365. PMID: 7920243 DOI: 10.1101/gr.3.6.365.
8 Dian Yosi Arinawati et al., Saliva as Diagnostic Medium to Detect Infectious Disease in Human Body: A Review. Advances in Health Sciences Research. Available Online 26 December 2022.DOI 10.2991/978-94-6463-070-1_50.
9 You Li et al., Trends in the global burden of lower respiratory infections: the knowns and the unknowns The Lancet Infectous Diseases, Published: August 11, 2022, DOI: https://doi.org/10.1016/S1473-3099(22)00445-5.
10 Xuting Jin et al., Global burden of upper respiratory infections in 204 countries and territories, from 1990 to 2019, eClinicalMedicine Open Access Published:J une 28, 2021, DOI:https://doi.org/10.1016/j.eclinm.2021.100986.
