BiMoC Acanthamoeba castellani Real time PCR - ready per PCR Digitale

REAL TIME PCR PER IL RILEVAMENTO E LA QUANTIFICAZIONE DI ACANTHAMOEBA CASTELLANI (anche in  per PCR digitale)

Background
L'Acanthamoeba è un'ameba microscopica a vita libera comunemente presente nell'ambiente che può causare malattie rare ma gravi. I parassiti Acanthamoeba spp. sono stati trovati in suolo; acqua dolce, salmastra e di mare; liquami; piscine; apparecchiature per lenti a contatto; piscine medicinali; unità di trattamento odontoiatrico; macchine per dialisi; sistemi di riscaldamento, ventilazione e condizionamento dell'aria; colture cellulari di mammiferi; verdure; narici e gole umane; tessuti cerebrali, cutanei e polmonari umani e animali [1].
L'Acanthamoeba ha due fasi del ciclo vitale: cisti (1) e trofozoiti (2). I trofozoiti sono le forme infettive, sebbene sia le cisti che i trofozoiti possano penetrare nel corpo attraverso l'occhio, i seni nasali, la pelle ulcerata . Quando il parassita Acanthamoeba spp. entra nell'occhio, può causare grave cheratite in individui altrimenti sani, in particolare negli utilizzatori di lenti a contatto. Quando la penetrazione avviene  dal sistema respiratorio o attraverso la cute, può invadere il sistema nervoso centrale mediante disseminazione ematogena provocando encefalite amebica granulomatosa (GAE) o malattie disseminate o lesioni cutanee in soggetti con sistema immunitario compromesso [2].
La diagnosi di laboratorio precoce e definitiva delle infezioni da Acanthamoeba e in particolare della cheratite e il tempestivo inizio di una terapia appropriata sono essenziali per una prognosi clinica favorevole.
Tradizionalmente, per diagnosticare l'infezione sono stati utilizzati il ​​rilevamento di trofozoiti e di cisti di Acanthamoeba in preparati citologici o la crescita di Acanthamoeba in coltura; tuttavia, la PCR (Reazione polimerasica a catena) si è rivelata più sensibile. La PCR Real time viene oggi utilizzata come uno strumento efficace per testare più rapidamente campioni clinici per il rilevamento di agenti infettivi, inclusa Acanthamoeba [3].
Sebbene la cheratite da Acanthamoeba sia ancora una malattia relativamente rara, l’incidenza tra i portatori di lenti a contatto morbide è aumentata fino a raggiungere 1 su 21.000 nel 2015. I trattamenti falliscono soprattutto quando la diagnosi avviene in uno stadio di gravità elevata dell’infezione [4].

Scopo
Considerando che la diagnosi precoce e definitiva di laboratorio dell’infezione da Acanthamoeba e il tempestivo inizio di una terapia appropriata sono essenziali per una prognosi clinica favorevole e che esistono pochi test molecolari, nessuno con certificazione IVD e CE, BiMoC ha sviluppato una Real time PCR economica e sensibile per la quantificazione sia di cisti che di trofozoiti in vari tipi di campioni e da utilizzare anche con Digital PCR.

Campioni analizzabili
Cisti e trofozoiti, liquido per lenti, tampone per lenti, tamponi oculari, raschiamento corneale, plasma, siero.

Protocollo
Target, gene 18SrRNA. Estrazione del DNA mediante kit Eurospital (automatizzato) dopo pretrattamento BiMoC B&B (vedi notizie). Real Time PCR  utilizzando primer e sonde BiMoC, denominate ACA-F, ACA-R, ACA-P con DNA IC. Rileva 40 specie.

Validazione
Il sistema è stato validato utilizzando campioni di cisti e trofozoiti precedentemente quantificati e campioni di liquido di lenti a contatto, lacrime e campioni oculari. Tutti i campioni sono stati analizzati tre volte.

Risultati
Tutti i campioni sono risultati positivi e l'IC interno è stato coamplificato. È stata creata una curva standard per la quantificazione.

Conclusioni
La BiMoC Real Time PCR associata al pretrattamento BiMoC B&B è un sitema rapido, sensibile e specifico adatto per la rilevazione di Acanthamoeba castellani.


Se vuoi saperne di più contatta BiMoC: info@bimoc.it


REAL TIME PCR FOR DETECTION AND QUANTIFICATION OF ACANTHAMOEBA CASTELLANI ready for digital PCR

Background
Acanthamoeba is a microscopic, free-living ameba commonly found in the environment that can cause rare, but severe, illness. Acanthamoeba spp. have been found in soil; fresh, brackish, and sea water; sewage; swimming pools; contact lens equipment; medicinal pools; dental treatment units; dialysis machines; heating, ventilating, and air conditioning systems; mammalian cell cultures; vegetables; human nostrils and throats; and human and animal brain, skin, and lung tissues [1].
Acanthamoeba has two stages, cysts (1) and trophozoites (2), in its life cycle. The trophozoites are the infective forms, although both cysts and trophozoites gain entry into the body through various means, eye, nasal passages to the lower respiratory tract, or ulcerated or broken skin. When Acanthamoeba spp. enters the eye, it can cause severe keratitis in otherwise healthy individuals, particularly contact lens users. When it enters the respiratory system or through the skin, it can invade the central nervous system by hematogenous dissemination causing granulomatous amebic encephalitis (GAE) or disseminated disease or skin lesions in individuals with compromised immune systems [2].
Early definitive laboratory diagnosis of Acanthamoeba infections and in particular of keratitis and the prompt initiation of appropriate therapy is essential for a favorable clinical prognosis. Traditionally, detection of Acanthamoeba trophozoites and cysts in cytological preparations or growth of Acanthamoeba in culture have been used to diagnose the infection; however, conventional PCR has been found to be more sensitive. Real-time PCR has now emerged as an effective tool for more rapid testing of clinical samples for the detection of infectious agents, including Acanthamoeba [3].
Although Acanthamoeba keratitis is still a relatively uncommon disease, the incidence in soft contact lens wearers has increased to reach 1 in 21,000 in 2015. Treatments fails especially when the diagnosis occurs at high severity stage of the infection [4].

Aim
Considering that, early definitive laboratory diagnosis of Acanthamoeba infection and the prompt initiation of appropriate therapy is essential for a favorable clinical prognosis, and that there are few of molecular tests, none with IVD and CE certification, BiMoC has developed a cheap and sensitive Real PCR for the quantification of both cysts and trophozoites in various samples and to be used also with Digital PCR.

Samples
Cysts and trophozoites, lenses liquid, lenses swab, ocular swabs, corneal scraping, plasma, serum.         

Protocol
Target, 18SrRNA gene. DNA extraction kit, Eurospital (automated) after BiMoC B&B pretreatment. Real time PCR by using BiMoC primers e probes, named ACA-F, ACA-R, ACA-P and PCR mix with DNA IC. It detects 40 species.

Validazione
RT PCR was validated by using quantified Cystis and trophozoites and all samples above. All samples have been analyzed three times.

Results
All samples resulted positive and internal IC was co-amplified. A standard curve for quantification was created.

Conclusions
BiMoC Real time PCR is suitable for the detection of Acanthamoeba castellani.


For more information concact BiMoC: info@bimoc.it


BIBLIOGRAFIABIBLIOGRAPHY
1 https://www.cdc.gov/parasites/acanthamoeba/gen_info/acanthamoeba.html
2 F Marciano-Cabral et al.,  The increasing importance of Acanthamoeba infections, J Eukaryot Microbiol, 2000 Jan-Feb;47(1):29-36. doi: 10.1111/j.1550-7408.2000.tb00007.x.
3 Paul P. Thompson et al., Validation of Real-Time PCR for Laboratory Diagnosis of Acanthamoeba Keratitis J Clin Microbiol. 2008 Oct; 46(10): 3232–3236. doi: 10.1128/JCM.00908-08, PMCID: PMC2566128, PMID: 18701667.
4 Anna C Randag et al., The rising incidence of Acanthamoeba keratitis: A 7-year nationwide survey and clinical assessment of risk factors and functional outcomes, PLoS One 2019 Sep 6;14(9), PMID: 31491000, PMCID: PMC6731013 DOI:10.1371/journal.pone.0222092.



 


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